Лаборатория хемоавтотрофного биосинтеза

Основной задачей лаборатории является получение целевых продуктов с помощью микробиологического синтеза с целью решения комплекса проблем экологии, медицины и сельского хозяйства

Основные направления исследований

• Физиология хемолитотрофных микроорганизмов, биотехнологии на их основе
• Биомедицинское материаловедение: синтез новых материалов, изучение структуры и свойств; процессинг, определение областей применения
• Биомедицинское применение полимеров: оценка потенциальной токсичности in vitro и in vivo, реконструктивная хирургия, разработка новых форм систем доставки лекарств, биомедицинских изделий
• Фундаментальное обоснование и разработка научных основ конструирования экологически безопасных и адресных форм удобрений и препаратов для защиты культурных растений от вредителей и возбудителей болезней с адресным и контролируемым выходом активного начала.

Основные достижения

• С использованием комплексного углеродного субстрата и метаболической регуляции биосинтеза клеточных макромолекул синтезировано семейство многокомпонентных ПГА природными штаммами Ralstonia, содержащих в качестве макровключений, помимо 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата, мономеры 3-гидроксигексаноата и 4-гидроксибутирата. Впервые в качестве потенциальных продуцентов ПГА исследованы светящиеся бактерии из коллекции Института; 8 штаммов перспективны в качестве новых продуцентов ПГА. Получены мутантные штаммы (B-8565 и B-T2) с расширенным органотрофным потенциалом, способные к синтезу 4-х- и 5-ти компонентных ПГА, в т.ч. новой структуры. Клонирован и охарактеризован ген полигидроксиалканоат (ПГА)-синтазы класса I (phaC) бактерий Ralstonia eutropha B5786, сопоставление его структуры с синтазами штаммов, синтезирующих коротко- и среднецепочеченые ПГА, показали отсутствие прямой связи между молекулярной организацией ПГА-синтаз и способностью синтезировать ПГА той или иной структуры. Исследованы физико-химические свойства многокомпонентных ПГА и показано, что наличие в С-цепи среднецепочеченых мономеров снижают кристалличность и температурные характеристики, улучшая технологические свойства полимера.
• Исследованы закономерности и кинетика биоразрушения ПГА в пресных прудах с различной структурой экосистемы, в аэрируемых условиях и анаэробных черных илах, солоноводном озере Шира для которого характерна глубинная, и установлено, что разрушение ПГА имеет место не только в на глубине 3 м, но также в оксигенно-аноксигенном хемоклине на глубине 13 м и на глубине 20 м в монимолимнионе, для которого характерно отсутствие кислорода, присутствие сероводорода и низкие температуры (1-2 °С); в условиях тропиков в бухте Дам Бай в Восточном море (г. Нячанг, Вьетнам); в почвах. Установлено, что разрушаемость зависит от химического состава ПГА, геометрии изделия и способа получения, а также климато-географических условий среды и микробной составляющей. Разрушение ПГА сопровождается изменением степени кристалличности, снижением молекулярной массы и увеличением полидисперсности. На основе морфологического, биохимического и молекулярно-филогенетического анализа 16S рРНК идентифицированы штаммы-деструкторы ПГА: Uncultured Haliscomenobacter sp., Pseudomonas putida KT2440, Leptothrix sp. L18, Uncultured Variovorax sp. KL-93-1-6, Bacillus sp. IBP-V002, Enterobacter cloacae IBP-V001, и Gracilibacillus sp. IBP-V003, депонированы в базе данных GenBank NSBI под номерами AJ583816, AJ583805, AJ583808, AJ583810, HM021764, HM021765, HM021766. Информация о способности представителей родов Gracilibacillus и Enterobacter разрушать ПГА получена впервые.
• С использованием серии высокоочищенных образцов разрушаемых биополимеров различного химического строения сконструированы пленочные и объемные полимерные матриксы, полученные методом электростатического формования, прессования с последующей техникой выщелачивания или лиофилизации. Исследованы адгезия и рост клеток в зависимости от структуры поверхности матриксов и условия дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Сконструированы гибридные матриксы для реконструктивного тканегенеза, несущие кератиноциты или остеобласты, а также лекарственные препараты.
• Результаты доклинических исследований ПГА показали высокую биосовместимость изделий различных типов и соответствии требованиям, предъявляемым к материалам биомедицинского назначения. Впервые исследована реакция крови и тканей (мышечной, костной, внутренних органов) на имплантацию ПГА в виде изделий различной геометрии, течение регенераторного процесса и ответная реакция тканей, характеризующаяся непродолжительным посттравматическим асептическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул, иневолюционирующихся во времени. Установлено, что биодеградация ПГА in vivo зависит от типа изделий, способа и места введения, реализуется гуморальным и клеточными путями с участием макрофагальных клеток; процесс длителен, продолжающийся от нескольких месяцев до года и более, без резкой потери прочности изделий, в основном, за счет поверхностной эрозии.
• В экспериментах на лабораторных животных с модельными дефектами тканей показана перспективность применения разработанных изделий для реконструкции дефектов костной ткани и кожных покровов. Начаты пионерные клинических исследования, результаты которых показали, что объемные полимерные имплантаты и полимерный пломбировочный материал эффективны для лечения пациентов с травмами костей различной итиологии; пористые наноматриксы из ультратонких волокон, нагруженные антибиотиком, эффективны в качестве раневых покрытий в фазе регенерации у пациентов с острой гнойной инфекцией мягких тканей. Разработаны практические рекомендации для расширения клинических исследований, предложены и освоены методики применения разработанных полимерных изделий. Проведена сертификация выпускаемых созданным в рамках проекта ООО «Биопласт» опытных партий полимеров и полимерных изделий; разработаны и зарегистрированы Технические условия на ряд изделий; организован выпуск малых партий полимеров и изделий под маркой «БИОПЛАСТОТАН».
• C использованием высокоочищенных образцов полигидроксиалканоатов различного состава, отработана методика конструирования полимерных микрочастиц, нагруженных лекарственными препаратами; получено семейство экспериментальных образцов полимерных микрочастиц различного диаметра, нагруженных различными лекарственными препаратами. Разработан методика применения лекарственной формы в виде микрочастиц для местного введения в организм; лекарственная эффективность микрочастиц, нагруженных ДОХ, доказана в эксперименте на лабораторных мышах с солидной формой карциномы Эрлиха (КЭ. Впервые показано, что разработанная экспериментальная форма доксорубицина, депонированного в микрочастицы из резорбируемого полимера «БИОПЛАСТОТАН», пригодна для местного введения в зону формирования опухоли. Ингибирующий эффект экспериментальной формы препарата сопоставим по действию со свободной формой доксорубицина, вводимого еженедельно внутривенно, но в отличие от последнего, без негативного влияния на систему крови.
• Исследованы условия взаимодействия химических препаратов с полимерами класса полигидроксиалканоаты (ПГА) в различных фазовых состояниях, на этой основе – отработанны методы депонирования препаратов, предназначенных для подавления возбудителей болезней растений и сорняков, а также удобрений, в полимерные матриксы различной формы; получен положительный результат оценки эффективности применения разработанных долговременных форм препаратов в лабораторных условиях в охарактеризованных почвенных экосистемах с высшими растениями, зараженными фитопатогенами и сорными растениями.

Основные приборы и оборудование

• ферментационная линия «Bioengineering», включающая посевной ферментер объемом 30 л и производственный ферментер объемом 150 л, комплекс ферментеров BioFlo 115 с объемом аппаратов 8 л и 12 л; шейкеры-инкубаторы Innova 44 – 2 шт., термостаты «Binder» – 3 шт., компрессор «Remeza», воздуходувка, газовый хроматограф Agilent, парогенератор «Biotron», вакуум-выпарной аппарат, комплект центрифуг «Avanti» и «Eppendorf», комплект автоклавов «Sanyo» MLS-3781L, pH-метр S-20К «Mettler Toledo», генератор водорода PH-100, перистальтические насосы Flowmaster FMT300 «Ismatec», весы Analytical balance DV 215CD «Ohaus», набор роторных испарителей R/210V «Buchi» и «Heidolph»;
• гельпроникающая хроматография «Agilent» и «Waters», мультимодальный планшетный ридер LB 940 Mithras Research II «Berthold Technologies», УФ – спектрофотометр «Agilent» Cary 60, комплект оборудования для определения паро- и газопроницаемости пленок «Mocon», разрывная испытательная машина «Instron», сканирующий калориметр DSK «Mettler Tolledo»;
• хромато-масс-спектрометр Agilent 6890N/5975inter («Agilent Technologies», USA); жидко-жидкостной хроматограф с масс – спектрометром – Agilent 1100 Series LS/MSD («Agilent Technologies», USA); газовый хроматограф Agilent 6890 с детекторами ДЭЗ и ПИД («Agilent Technologies», USA);
• Атомно-абсорбционные спектрофотометры Квант 2а («Кортек», Россия); атомно-эмиссионный спектрометр с индуктивно связанной плазмой ICAP6300DUO («Thermo Scientific» INTERTECH Corporation); CN-анализатор Flash EA 1112NC («Neolab»); фотоколориметры и спектрофотометры.

Сотрудники

Заведующая лабораторией Волова Татьяна Григорьевна доктор биологических наук, профессор +7 391 2494428 volova45@mail.ru